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Choline,雞膽堿ELISA試劑盒原理

更新時間:2022-08-27

簡要描述:

Choline,雞膽堿ELISA試劑盒原理用于體外定量檢測血清、血漿、組織、細胞上清及相關(guān)液體樣本中雞膽堿(Choline)的含量。

型號:點擊量:610

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一.實驗原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,又保留酶的活性。在測定時,受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體,也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。

二.實驗材料與試劑配制

1.儀器與材料:酶標儀(使用前預(yù)熱30分鐘),微量加液器、吸頭、蒸餾水或去離子水,濾紙。

2. 洗液的配制:按1:30的比例配制洗液備用。

三.樣品收集、處理及保存

1).細胞培養(yǎng)上清:

適用于檢測體外培養(yǎng)的細胞分泌性成份。用無菌管收集細胞上清液,以1000×g離心15分鐘,收集上清。

2)細胞:

用PBS反復(fù)洗滌細胞3次,調(diào)整細胞濃度達到104-106/ml 左右,通過反復(fù)凍融,使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份,或者細胞超聲粉碎,離心取上清液檢測。

3)血清:

在室溫下,血液自然凝固,以1000×g離心15分鐘,取上清待測。

4)血漿:

應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合后靜置10-20 分鐘后,以1000×g離心15分鐘,收集上清。

5)體液:

包括胸腹水、腦脊液,分泌物等。使用不含熱原和內(nèi)毒素的離心管收集,以1000×g離心15分鐘,收集上清。

6.)組織標本:

切取組織標本,稱取重量0.5mg,加入500ul 的PBS,用手工或勻漿器,或超聲破碎儀將標本勻漿,以2000-3000 rmp離心20 分鐘,收集上清進行檢測。

樣品中不能含有NaN3,因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

7)保存:

如果樣品不能立即檢測,應(yīng)將其分裝,-70 ℃保存,避免反復(fù)冷凍。保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。血液標本盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

四.操作步驟

1)取出試劑盒,室溫(20-25℃)放置30分鐘。

2)分組:取出96孔板,根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),把剩余的板條繼續(xù)冷藏處理。分別設(shè)標準品組(6個濃度)、空白孔、待測樣品組。

3)標準品的稀釋:準備小試管6 只,依次編好號碼,先在各小試管中加入標準品稀釋液100ul,然后取原濃度標準品100ul加入一只已編好號的試管中,充分混勻;再在該試管中取100ul 加入第二支試管中,充分混勻;再在該試管中取100ul加入第三只試管中,充分混勻;再在該試管中取100ul 加入第四只試管中,充分混勻;再在該試管中取100ul加入第五只試管中,充分混勻;然后在該試管中取100ul,棄掉。第六只試管作為0 號標準品。

注:為減少實驗誤差,保證準確性,建議設(shè)置復(fù)孔。

4)加樣:依照標準品的順序分別加入50ul的標準品溶液于空白微孔中;空白對照孔加入50ul的蒸餾水;其余微孔中先加樣品40ul然后再加生物素標記的抗體10ul。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。

5)溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。

6)洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 秒棄去,如此重復(fù)5 次,拍干。

7)加酶標溶液:標準品組、待測樣本組各孔中加入50ul的酶標溶液(空白對照孔除外)。

8)溫育:酶標板用封板紙密封后,放入濕盒內(nèi)于37℃恒溫孵育1小時。

9)洗板:用稀釋后的洗滌液注滿每孔,靜置15-30s,充分清洗酶標板5次,用吸水紙*拍干。

10)顯色:各孔加入顯色劑A液50ul后,再加入顯色劑B液50ul。

11)終止:25-37℃下避光反應(yīng)10-15分鐘,加入50ul終止液。

12)讀板:在450nm波長讀取各孔的OD值。

注:讀板時必須拭干板底殘留的液體和手指痕跡,讀板時間控制在終止反應(yīng)后的30分鐘內(nèi),以免影響準確性。

五.數(shù)據(jù)計算

以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,在坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度;或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,即為樣品的實際濃度。

六.注意事項

1)實驗操作中必須使用一次性吸頭,避免交叉污染。

2)加樣:加樣時,要控制加樣速度,避免*孔與zui后一孔間的時間間隔過大,否則將會導(dǎo)致不同的預(yù)孵育時間,從而影響實驗的準確性以及重復(fù)性。

3)孵育:嚴格按照說明書上規(guī)定的孵育時間和溫度進行。

反應(yīng)時間的控制:加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化,如果顏色較深,請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)。

4)建議實驗前預(yù)測樣品含量,如樣品濃度過高,應(yīng)對樣品進行稀釋,計算結(jié)果時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

5)建議使用本試劑盒時先做預(yù)實驗(即先做標準曲線,試用幾個標本),如果對本試劑盒有任何疑問,可和所購經(jīng)銷商,如果因運輸過程導(dǎo)致試劑盒失效,可要求調(diào)換,但概不承擔(dān)產(chǎn)品本身以外的任何損失。

七.保存條件及有效期

1.試劑盒保存:2-8℃

2.有效期:6個月

八.訂貨說明

1)賣方確保所訂產(chǎn)品與目錄技術(shù)指標保持*;

2)為了確保買方產(chǎn)品在運輸中的質(zhì)量,對有特殊要求的低溫產(chǎn)品予以濕冰運輸。

3)收到貨物后如出現(xiàn)質(zhì)量問題,買方需在收到貨物一個月內(nèi)向賣方提出書面異議。買方逾期不提出異議,視為貨物符合其要求,賣方不付任何責(zé)任。

4)出現(xiàn)質(zhì)量以外的問題,如破損等,買方應(yīng)在收貨后一個周內(nèi)提出。買方未按時提出異議,視為該產(chǎn)品合格。

本公司對所有售出的產(chǎn)品保證質(zhì)量,并提供良好的售后服務(wù),有關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的投訴,請在收到貨物的32天內(nèi)以書面形式提出,并向我公司技術(shù)人員提供相應(yīng)的材料,我們會及時派人解決。所有形式的賠償或退換僅限于產(chǎn)品本身,不涉及其他間接內(nèi)容。凡購買本公司任意款elisa試劑盒,均可享受免費代測服務(wù),并提供技術(shù)指導(dǎo)。

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