人胎球蛋白A檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)全過程詳解
　　
　　預(yù)期用途
　　
　　此試劑盒可用于血清，血漿，細(xì)胞上清，組織提取物和尿液中人胎球蛋白A也稱之為α-2-HS糖蛋白的定量的檢測；血清或血漿中胎球蛋白A的檢測可作為某些癌癥及基因遺傳缺陷的血清蛋白診斷的輔助工具；此試劑盒僅供實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人士使用
　　
　　簡介
　　
　　胎球蛋白A也稱之為α-2-HS糖蛋白，是由兩個(gè)氨基末端抑制域和一個(gè)較小的羧基末端域組成的59kDa分子量的糖蛋白；由肝臟合成，分泌至血流，成年哺乳動物體內(nèi)的濃度范圍在0.5-1.0g/L；嬰兒期的血清胎球蛋白A含量高，參與蛋白酶抑制活性，與鈣代謝和骨調(diào)節(jié)相關(guān)；累積于骨和牙齒內(nèi)，作為生物學(xué)上非膠原骨蛋白的主要部分，研究表明，胎球蛋白A是循環(huán)中主要的鈣化抑制劑；干涉鈣鹽沉淀；近期研究顯示低水平胎球蛋白A的慢性腎臟衰竭患者與心血管病的高死亡率顯著相關(guān)；另一方面，糖尿病老年人血清胎球蛋白A含量比正常人高，這是獨(dú)立于胰島素抑制劑的其他標(biāo)記物；另外，高胎球蛋白A水平還可作為心血管疾病的的危險(xiǎn)標(biāo)記物
　　
　　實(shí)驗(yàn)原理
　　
　　此試劑盒可用于血清樣本中人胎球蛋白A的定量檢測；采用雙位點(diǎn)夾心法，羊抗人胎球蛋白A多抗結(jié)合人胎球蛋白A的不同位點(diǎn)
　　
　　將含人胎球蛋白A的試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品和預(yù)稀釋樣本加至包被了高度親和羊抗人胎球蛋白A多抗的微孔內(nèi)，*次孵育，包被抗體捕獲樣本中的人胎球蛋白A，未結(jié)合的蛋白洗板除去，然后加入HRP標(biāo)記的抗人胎球蛋白A酶聯(lián)物加入至每孔，“夾心-人胎球蛋白A-HRP-標(biāo)記的酶聯(lián)物”形成夾心，未結(jié)合的示蹤抗體通過洗板除去，結(jié)合于包被板上的HRP酶免物與底物液定時(shí)反應(yīng)，然后在酶標(biāo)儀上檢測；結(jié)合于包被胎球蛋白A上示蹤抗體酶活性與樣本中胎球蛋白A的含量直接相關(guān)，在點(diǎn)對點(diǎn)或三次回歸模式下以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度比上OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣本中的胎球蛋白A可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到
　　
　　試劑：準(zhǔn)備與貯存
　　
　　此試劑盒收到后立即貯存于2-8℃下，效期見試劑盒標(biāo)簽；所有成分在2-8℃下可保存至有效期
　　
　　使用前，所有試劑平衡至室溫，不同批次的試劑不能交換使用
　　
　　包被板，96孔，包被了抗人胎球蛋白A抗體；微孔板固定于板架上，密封于含有干燥劑的鋁箔密封袋內(nèi)；貯存于2-8℃至有效期
　　
　　胎球蛋白A示蹤抗體，1瓶，0.6ml，濃縮，HRP標(biāo)記的抗人胎球蛋白A示蹤抗體溶于穩(wěn)定的蛋白基質(zhì)中；此試劑使用前需用示蹤劑抗體稀釋液進(jìn)行稀釋；貯存于2-8℃至有效期
　　
　　示蹤抗體稀釋液，1瓶，11ml，即用，Trizma鹽酸溶于緩沖液；根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟用于示蹤抗體稀釋；貯存于2-8℃至有效期
　　
　　試驗(yàn)緩沖液，濃縮，1瓶，11ml，含牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽；建議使用前以1:10比例用雙蒸水稀釋（如11ml濃縮+99ml的雙蒸水）；貯存于2-8℃至有效期
　　
　　洗滌液，濃縮，1瓶，20ml，30倍濃縮；試驗(yàn)前需用580ml的雙蒸水稀釋，混勻；一旦稀釋，不含疊氮化物防腐劑的磷酸緩沖鹽洗滌液會含表面活性劑；稀釋的洗滌液在室溫下可保存至效期
　　
　　HRP底物液；1瓶，12ml，含過氧化氫的TMB底物液；貯存于2-8℃至有效期
　　
　　終止液，1瓶，12ml，0.5M硫酸，貯存于2-8℃至有效期
　　
　　胎球蛋白A標(biāo)準(zhǔn)品，5瓶，含胎球蛋白A，不含疊氮化物防腐劑的液態(tài)牛血清基質(zhì)；各標(biāo)準(zhǔn)品濃度見瓶子標(biāo)簽；3次凍存周期使用后，所有標(biāo)準(zhǔn)品保存至-20℃或更低
　　
　　胎球蛋白A質(zhì)控，2瓶，含人胎球蛋白A，不含疊氮化物防腐劑的液態(tài)牛血清基質(zhì)，各質(zhì)控的濃度范圍見瓶子標(biāo)簽，3次凍存周期使用后質(zhì)控保存至-20℃或更低
　　
　　安全注意事項(xiàng)
　　
　　此試劑用于臨床參考實(shí)驗(yàn)室，僅供醫(yī)生或?qū)嶒?yàn)室專業(yè)人士體外診斷用
　　
　　若試劑是有潛在感染風(fēng)險(xiǎn)的，試驗(yàn)操作和處理時(shí)應(yīng)戴手套
　　
　　避免接觸含TMB，過氧化氫，硫酸的試劑，TM,B會刺激皮膚和粘膜，導(dǎo)致皮膚過敏反應(yīng)；TMB還可能是致癌物質(zhì)；皮膚接觸到硫酸會導(dǎo)致嚴(yán)重灼傷，不要接觸到眼睛，皮膚，衣服，不要吸入煙霧，一旦接觸，應(yīng)立即用大量水沖洗至少15min
　　
　　良好實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范
　　
　　實(shí)驗(yàn)所需材料但試劑盒未提供
　　
　　的單通道移液器，10-25-100-1000ul
　　
　　適于100ul的可重復(fù)用分液器
　　
　　適于所有體積的一次性槍頭
　　
　　一次性玻璃管或塑料管12x75mm或13x100mm
　　
　　帶蓋的一次性塑料瓶；100-1000ml
　　
　　鋁箔紙
　　
　　雙蒸水或去離子水
　　
　　塑料蓋板或聚乙烯薄膜
　　
　　多通道洗滌瓶或全自動（半自動）洗板系統(tǒng)
　　
　　酶標(biāo)儀，450nm
　　
　　樣本采集
　　
　　人胎球蛋白A的檢測所需血清或血漿樣本量僅10ul
　　
　　個(gè)人在采樣前無需特殊準(zhǔn)備，全血采集，室溫下立即凝集30min，然后離心分離出血清（850-1500xg10min）。全血采集3小時(shí)內(nèi)需將血清從凝集中分離出來，轉(zhuǎn)移至另一干凈試管；血清樣本可保存在-20℃或更低，避免超過三次的凍融
　　
　　建議采用24小時(shí)尿液來檢測尿液中的胎球蛋白A；采集第二天早晨的尿液，排除采樣前剛進(jìn)行劇烈運(yùn)動的，因腎功能不全導(dǎo)致多尿的；由利尿藥引起的人體內(nèi)尿蛋白含量波動降低，可能與尿肌酸酐濃度相關(guān)；
　　
　　細(xì)胞上清，組織提取物則需進(jìn)行試驗(yàn)樣本的倍比稀釋；多個(gè)平行樣檢測得到更的試驗(yàn)結(jié)果
　　
　　實(shí)驗(yàn)步驟
　　
　　患者樣本的準(zhǔn)備
　　
　　患者血清或血漿樣本在檢測前需用試驗(yàn)緩沖液進(jìn)行1:10000的稀釋
　　
　　以1A和1B標(biāo)記兩個(gè)試管（12x75mm）
　　
　　加1ml的試驗(yàn)緩沖液至各試管（1A和1B）
　　
　　加10ul的患者血清至1A試管，混合（1:100）
　　
　　從1A管內(nèi)吸取10ul已稀釋的樣本至1B試管，混合（1:10000）
　　
　　注意：建議采用/經(jīng)校準(zhǔn)的移液器，稀釋過程小心操作，得到更的結(jié)果；建議采用多通道（Combitip）12.5ml的Eppendorf可重復(fù)移液器加1ml的試驗(yàn)緩沖液，而不用50ml的槍頭
　　
　　患者尿液樣本的實(shí)驗(yàn)前用試驗(yàn)緩沖液1:100的稀釋
　　
　　以1標(biāo)記一試管（12x75mm）
　　
　　各管加1ml試驗(yàn)緩沖液
　　
　　加10ul患者尿液樣本至1管，混合（1:100）
　　
　　注意：若所得結(jié)果中樣本濃度高于5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品中的zui高標(biāo)準(zhǔn)品濃度，則尿液樣本需進(jìn)一步稀釋（如1:500），然后重新檢測
　　
　　試劑準(zhǔn)備
　　
　　試驗(yàn)前將所有試劑平衡至室溫，不同批次的試劑不能混合使用
　　
　　使用前，試驗(yàn)緩沖液（濃縮）及洗滌液（濃縮）需進(jìn)行稀釋，配制成工作液；詳情請見“試劑”部分
　　
　　試驗(yàn)操作
　　
　　將實(shí)驗(yàn)所需板條固定于板架上，標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品及未知樣本做雙孔檢測
　　
　　試驗(yàn)布局
　　
　　ROWSTRIP1STRIP2STRIP3
　　
　　ASTD1STD5SAMPLE2
　　
　　BSTD1STD5SAMPLE2
　　
　　CSTD2C1SAMPLE3
　　
　　DSTD2C1SAMPLE3
　　
　　ESTD3C2
　　
　　FSTD3C2
　　
　　GSTD4SAMPLE1
　　
　　HSTD4SAMPLE1
　　
　　加25ul的標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品及預(yù)稀釋的1:10000樣本至相應(yīng)孔內(nèi)；注意：尿液樣本是1:100的稀釋
　　
　　每孔加100ul的試驗(yàn)緩沖液
　　
　　混勻，蓋板，避免暴露于陽光下
　　
　　室溫下孵育2小時(shí)
　　
　　示蹤抗體工作液的準(zhǔn)備，示蹤抗體1:21的用示蹤抗體稀釋液稀釋；每條板需1ml的示蹤抗體稀釋液+50ul的胎球蛋白A示蹤抗體
　　
　　移去蓋板，棄去孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔加350ul的洗滌工作液洗板5次，然后*吸出孔內(nèi)液體，或可采用全自動洗板機(jī)
　　
　　以上稀釋的示蹤抗體工作液加100ul至各孔
　　
　　蓋板，避免暴露于陽光下
　　
　　室溫下孵育30min
　　
　　移去蓋板，棄去孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔加350ul的洗滌工作液洗板5次，然后*吸出孔內(nèi)液體，或可采用全自動洗板機(jī)
　　
　　每孔加100ul的ELISAHRP底物液
　　
　　蓋板，避免暴露于陽光下
　　
　　室溫下孵育20min
　　
　　移去蓋板，每孔加100ul的終止液，混勻
　　
　　10min內(nèi)在450nm酶標(biāo)儀上檢測吸收值
　　
　　注意：為降低背景色，可以雙波長檢測，設(shè)置參考波長：595nm或620nm或630nm
　　
　　操作注意事項(xiàng)
　　
　　建議所有標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品和未知樣本做雙孔檢測；各雙孔檢測的吸收均值用于數(shù)據(jù)處理，結(jié)果計(jì)算
　　
　　將光敏試劑保持裝于原琥珀色瓶內(nèi)
　　
　　將剩余的包被板條放存在含干燥劑的密封袋內(nèi)，避免受潮
　　
　　操作嚴(yán)格，移液器經(jīng)校準(zhǔn)可確保試驗(yàn)的可重復(fù)性
　　
　　孵育時(shí)間或溫度也可能會影響試驗(yàn)結(jié)果
　　
　　避免微孔內(nèi)產(chǎn)生氣泡，可能會導(dǎo)致結(jié)合率低，雙孔讀數(shù)變異系數(shù)高
　　
　　使用前所有試劑都應(yīng)*混勻，避免產(chǎn)生氣泡
　　
　　結(jié)果說明
　　
　　計(jì)算各雙孔吸收值均值
　　
　　所有的吸收均值都減去標(biāo)準(zhǔn)品1（即0ng/ml）的吸收均值
　　
　　在點(diǎn)對點(diǎn)或?qū)?shù)-對數(shù)坐標(biāo)紙上以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為X軸，吸收均值為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；或是采用數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行結(jié)果計(jì)算
　　
　　質(zhì)控品和樣本濃度（1:10000）可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取，若采用的是對數(shù)-對數(shù)或數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算則需用到對數(shù)轉(zhuǎn)換；樣本校正吸收值在濃度1ng/ml和下一個(gè)zui高標(biāo)準(zhǔn)品間的需通過公式計(jì)算：
　　
　　未知樣本濃度=未知樣本吸收值x2nd標(biāo)準(zhǔn)品濃度值