菌種在分離、保藏和生產(chǎn)過程中,極易遭致雜菌污染,因此必須對(duì)染有雜菌的菌種進(jìn)行提純,方能用于生產(chǎn)。根據(jù)污染的類型和程度,需采用不同的純化措施。
1. 排除細(xì)菌或酵母菌污染
在菌種培養(yǎng)中,用肉眼仔細(xì)觀察培養(yǎng)基表面,不難發(fā)現(xiàn)被細(xì)菌或酵母菌污染的分離物常出現(xiàn)黏稠狀的菌落。取被純化物接種在無冷凝水、硬度較高(瓊脂用量2.3%~2.5%)的斜面上,再降低培養(yǎng)溫度至15~20℃,利用某些大型真菌在較低的溫度下,菌絲生長(zhǎng)速度比細(xì)菌蔓延速度快的特點(diǎn),用尖細(xì)的接種針切割菌絲的前端,轉(zhuǎn)接到新的試管斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng),連續(xù)2~3次就能獲得所要的純菌絲。也可打破試管,挑取內(nèi)部長(zhǎng)有基內(nèi)菌絲的瓊脂塊,移入無冷凝水的培養(yǎng)基上,該法適于被好氣性細(xì)菌污染的母種。
2. 排除霉菌污染
霉菌和細(xì)菌不同,它和食用菌菌絲很相似,也有氣生菌絲和基內(nèi)菌絲。分離的方法主要是抑制雜菌生長(zhǎng),拉大食用菌菌絲生長(zhǎng)和雜菌菌絲生長(zhǎng)的范圍差,從食用菌菌落前端切割,移植入新培養(yǎng)基。雜菌發(fā)現(xiàn)越早,分離的成功率越大。嚴(yán)格地說,在斜面培養(yǎng)基上的非接種部位發(fā)現(xiàn)的白色菌絲,應(yīng)認(rèn)為是雜菌菌落,應(yīng)馬上提純。若有色孢子已出現(xiàn),一方面易使分生孢子飄散,另一方面其基內(nèi)菌絲早已蔓延,可能和食用菌菌絲混生一起。如霉菌剛出現(xiàn)孢子且尚未成熟、變色,則可采用前端菌絲切割法提純。轉(zhuǎn)管時(shí)先將菌絲接種在斜面jian端,當(dāng)長(zhǎng)滿斜面后,及時(shí)將原接種點(diǎn)連同培養(yǎng)基一起挖掉;如霉菌菌落顏色已深,說明孢子已成熟,稍一振動(dòng)孢子就會(huì)飄滿培養(yǎng)基,若再行上法意義不大。如菌絲蔓延范圍較大,可將0.2%升gong溶液或1%多菌靈處理過的濕濾紙塊覆蓋在霉菌的菌落上,可抑制霉菌生長(zhǎng),防止孢子擴(kuò)散,后用滅菌接種鏟將表層鏟掉,隨之用接種針鉤取基內(nèi)菌絲移入新的培養(yǎng)基,如此2~3次。
3. 限制培養(yǎng)
取直徑7~10毫米、高4~6毫米的玻璃環(huán)或不銹鋼環(huán),經(jīng)酒精燈火焰灼燒后趁熱放到斜面培養(yǎng)基中央,將環(huán)的一半嵌入培養(yǎng)基內(nèi),然后將染有細(xì)菌的接種塊放入環(huán)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)菌生長(zhǎng)會(huì)被限制在環(huán)內(nèi),而食用菌菌絲則可越過環(huán)而長(zhǎng)到環(huán)外的培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)管后即可得到純化。
4. 覆蓋培養(yǎng)
在污染了細(xì)菌的食用菌菌絲斜面上傾注一層厚約2毫米的培養(yǎng)基,培養(yǎng)一段時(shí)間,當(dāng)食用菌菌絲透過培養(yǎng)基形成新的菌落時(shí),即可切割轉(zhuǎn)管。最好進(jìn)行二次覆蓋。
5. 基質(zhì)菌絲純化培養(yǎng)
對(duì)棉塞長(zhǎng)有霉菌的試管斜面,可將試管打碎,取出培養(yǎng)基,用0.1%升gong浸泡2分鐘,用無菌水淋洗,再用無菌濾紙吸干。取一段2厘米的培養(yǎng)基從中部切開,在斷面上用無菌刀片切成米粒大小的塊,移入新的斜面上進(jìn)行培養(yǎng)。
6. 藥物處理
菌種提純時(shí),可向培養(yǎng)基中注入選擇性強(qiáng)的抗菌制劑,如加入 5~10毫克/升的多菌靈(MBC)、涕必靈(TBZ)或托布津等,可有效地防止菌霉混生;在每毫升培養(yǎng)基中加入30~40毫克鏈霉素、20~30毫克四環(huán)素、金霉素,或50毫克高錳酸鉀,可以有效地防止細(xì)菌混生;加入灰黃霉素(20單位/毫升),可抑制真菌生長(zhǎng)。
7. 破碎菌絲
從試管中取出已污染的培養(yǎng)基,放在0.1%升gong水中處理2分鐘,用無菌水沖洗,無菌紙吸干,再放入有玻璃珠的無菌水內(nèi),經(jīng)組織破碎,稀釋后注入平板培養(yǎng),取其單個(gè)菌落純化培養(yǎng)。