酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)是一種常用的固相免疫測(cè)定方法,被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體的測(cè)定?!度珖?guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》(2009年修訂版)中要求:各篩查實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行抗體檢測(cè)時(shí),先用第一種篩查試劑(高敏感性ELISA)檢測(cè),出現(xiàn)陰性反應(yīng)報(bào)告“HIV抗體陰性",出現(xiàn)陽性反應(yīng)時(shí)不可直接報(bào)告陽性結(jié)果,則用另一種不同原理或不同廠家的篩查試劑(高特異性ELISA)復(fù)檢,所以ELISA法目前普遍用于艾滋病病毒抗體(HIV抗體)初篩實(shí)驗(yàn)室用于HIV抗體的測(cè)定,但ELISA測(cè)定中影響因素較多,而且對(duì)檢驗(yàn)人員的操作技術(shù)要求也較高,因此,為了得到準(zhǔn)確可靠的檢驗(yàn)結(jié)果,必須對(duì)ELISA法中的諸多影響因素采取相應(yīng)的控制措施。目前,HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)室常用的是血液標(biāo)本。血液標(biāo)本常見的干擾因素有內(nèi)源性干擾和外源性干擾。
內(nèi)源性干擾因素:包括類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體等,這些因素的存在,常使結(jié)果出現(xiàn)假陰性或假陽性等偏差,針對(duì)這些問題,解決辦法:(1)用0.01mol/L,pH7.2PBS(磷酸鹽緩沖液)將標(biāo)本做1:1稀釋;(2)溫度56℃、時(shí)間30min將血清滅活。
外源性干擾因素:外源性干擾物質(zhì)常常是由于血液標(biāo)本在采集、保存、運(yùn)送等過程中操作不當(dāng)所造成,比如標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時(shí)間久、標(biāo)本凝集不全或加入抗凝血物質(zhì)等。針對(duì)這些問題,解決辦法:(1)盡量避免樣品溶血;(2)標(biāo)本采集后應(yīng)室溫下自然防置1h~2h,待血液凝固、xue塊收縮后再用1500~3000r/min離心15min,吸出血清;(3)血清標(biāo)本應(yīng)立即進(jìn)行測(cè)定,對(duì)于不能立即測(cè)定的標(biāo)本,需2℃~8℃保存,超過一周以上測(cè)定的標(biāo)本應(yīng)-20℃以下保存;(4)標(biāo)本中加入抗凝物質(zhì)時(shí),盡量避免使用酶抑制劑,以免造成對(duì)ELISA中酶活性的影響。
試劑的選擇:應(yīng)使用經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)的、敏感性高、特異性好的試劑;更換試劑批號(hào)時(shí),應(yīng)進(jìn)行平行試驗(yàn);試劑盒嚴(yán)格控制在有效期內(nèi)使用。
試劑的預(yù)處理:在ELISA法測(cè)定時(shí)試劑的預(yù)處理非常關(guān)鍵,也是較容易忽略的一個(gè)步驟,具體的做法:每次試驗(yàn)前,將試劑盒從冰箱內(nèi)取出,室溫下放置20min~30min,使試劑盒在使用前與室溫基本平衡一致,以免影響到抗原抗體的結(jié)合與反應(yīng)的速度。
溫度:是ELISA法測(cè)定中最為重要的一個(gè)問題,它直接決定著試驗(yàn)的成敗,所以在HIV抗體測(cè)定中一定要注意溫度的控制。ELISA以酶催化底物顯色來判斷結(jié)果,而抗原與抗體的合和酶催化底物的效率均與溫度密切相關(guān),溫度高,顯色深,S/CO值高,反之,顯色淺,S/CO值低,影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。
在日常實(shí)際操作時(shí),常忽略從室溫平衡的溫度逐步上升到37℃需要17min。為保證37℃下有足夠的反應(yīng)時(shí)間,各實(shí)驗(yàn)室可自行確定本實(shí)驗(yàn)室不同季節(jié)微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長(zhǎng)時(shí)間孔內(nèi)溫度才能達(dá)到37℃,從而適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)板在恒溫箱中的放置時(shí)間。具體的做法是,用一小溫度計(jì)單獨(dú)放置在非檢測(cè)樣品的空白板孔溶液中測(cè)量觀察。
加樣操作:加樣時(shí)注意不要有氣泡,將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不要觸及孔壁,加完后輕輕晃動(dòng)混勻,并在酶標(biāo)板上加覆膜。
洗滌與浸泡:反應(yīng)板的洗滌次數(shù)及浸泡時(shí)間的長(zhǎng)短,也直接影響著檢測(cè)結(jié)果,一般洗滌5~6次,浸泡時(shí)間每次為50s,洗滌次數(shù)過多或過少、浸泡時(shí)間過長(zhǎng)或過短容易造成假陰性或假陽性。
酶標(biāo)儀讀板:每次測(cè)定標(biāo)本吸光度前,要將酶標(biāo)儀開機(jī)預(yù)熱不低于20min,而且要在15min
內(nèi)判讀完畢。
室內(nèi)質(zhì)控品:是非試劑盒組份的外部質(zhì)控品,用來判斷本次實(shí)驗(yàn)樣品檢測(cè)的有效性。可以是商品或?qū)嶒?yàn)室自行制備。以該試劑盒臨界值(Cut-off)的2-3倍為宜。每次試驗(yàn)必須包含室內(nèi)質(zhì)控品,其結(jié)果無效,必須重新實(shí)驗(yàn)。
對(duì)于我們每一位檢驗(yàn)人員來說,不管是檢驗(yàn)標(biāo)本,還是檢驗(yàn)試劑、試驗(yàn)溫度、儀器設(shè)備等等,只要把握好每個(gè)環(huán)節(jié),就可以消除ELISA法在檢測(cè)HIV抗體中的諸多影響因素,就能保證為每位檢測(cè)者提供準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)結(jié)果。