注意:使用前請(qǐng)檢查試劑盒中試劑的標(biāo)簽和數(shù)量與表格是否一致。
需要但未提供的材料及耗材
1、酶標(biāo)儀(建議儀器使用前提前預(yù)熱)
2、精密移液器、吸頭、加樣槽
3、蒸餾水或去離子水
4、洗瓶或者自動(dòng)洗板機(jī)
5、37℃水浴鍋或恒溫箱
6、EP管
7、無(wú)粉一次性乳膠手套
【儲(chǔ)存條件及有效期】
1、2-8℃保存,切勿冷凍,有效期6個(gè)月。
2、開(kāi)封使用后,包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中,密閉自封袋,并將全部試劑放回2-8℃冰箱。
注意:試劑盒內(nèi)酶標(biāo)條可拆卸,按實(shí)驗(yàn)需求可分多次使用;使用后的剩余試劑盒建議在實(shí)驗(yàn)后1 個(gè)月內(nèi)使用完畢。產(chǎn)品過(guò)期時(shí)間以盒子上的標(biāo)簽為準(zhǔn),保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的。
【適用儀器】
半自動(dòng)的酶標(biāo)儀,如Thermo MK3,或者國(guó)產(chǎn)酶標(biāo)儀。
【樣本要求】
1.樣本類型和采集
血清:將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置0.5-2小時(shí)或4℃過(guò)夜,然后1000×g離心20 分鐘,取上清即可,或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
血漿:用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
組織勻漿:用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
細(xì)胞裂解液: 吸棄培養(yǎng)液,用PBS(0.01 M,pH 7.4)將細(xì)胞洗一遍。用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞(不能用胰酶和EDTA 處理),加入2-5 mL PBS(0.01 M,pH 7.4)。懸浮細(xì)胞可省略。收集細(xì)胞懸液,4℃ 1000×g離心10min,棄去培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗3次。加入適量的預(yù)冷PBS或非變性細(xì)胞裂解液(臨用前加入蛋白酶抑制劑)重懸細(xì)胞,通常6孔板一個(gè)孔的細(xì)胞量需要150-250μL PBS重懸。 將樣品放入-20℃或-80℃,使樣品冷凍,再放室溫解凍樣品,反復(fù)凍融3次,使細(xì)胞充分裂解,也可將樣品進(jìn)行超聲破碎,以達(dá)到裂解的目的。4℃ 10000×g 離心10min,除去細(xì)胞碎片,取上清即可檢測(cè),或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本:請(qǐng)1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.樣本保存和穩(wěn)定性
樣本在2-8℃條件下,可以儲(chǔ)存72h,在- 20℃或-80℃可以儲(chǔ)存6個(gè)月及以上。樣本收集后,不是一次檢測(cè)完,請(qǐng)按一次用量分裝凍存,避免反復(fù)凍融。
【注意事項(xiàng)】
1. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高(樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值),請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測(cè)定,計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。
2. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
3. 為免交叉污染,要避免重復(fù)使用手中的吸頭和試管。
4. 要嚴(yán)格避免操作過(guò)程中酶標(biāo)板干燥。干燥會(huì)使酶標(biāo)板上生物成份迅速失活。
5. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書的操作進(jìn)行,試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。
6. 顯色時(shí)間供參考,因用戶實(shí)驗(yàn)室條件差異,最佳顯色時(shí)間會(huì)有所不同。
7. 所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
8. 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
9. 揭封板膜和覆蓋封板膜時(shí)應(yīng)避免用力過(guò)大導(dǎo)致液體濺出。
【結(jié)果計(jì)算】
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。